рекомбинантный лентивирус

Эффективная трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными частицами в онкоиммунологических исследованиях

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ,

Е.К. Зайкова1,2, К.A. Левчук1, Д.Ю. Поздняков1, А.А. Дакс2, А.Ю. Зарицкий1, А.В. Петухов1,2,3

1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

2 Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр-т, д. 4, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194064

3 Научно-технологический университет «Сириус», Олимпийский пр-т, д. 1, Сочи, Российская Федерация, 354340

Для переписки: Екатерина Константиновна Зайкова, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; e-mail: Catherine3452@yandex.ru

Для цитирования: Зайкова Е.К., Левчук К.A., Поздняков Д.Ю. и др. Эффективная трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными частицами в онкоиммунологических исследованиях. Клиническая онкогематология. 2020;13(3):295–306.

DOI: 10.21320/2500-2139-2020-13-3-295-306

РЕФЕРАТ

Цель. Сравнить разные методы концентрации лентивирусных частиц для выбора оптимального способа, обеспечивающего высокий уровень трансдукции для получения CAR T-клеток в лабораторных условиях.

Материалы и методы. Концентрирование лентивирусного супернатанта проводилось 4 способами: ультрафильтрацией, ультрацентрифугированием, осаждением водорастворимым неионным полимером полиэтиленгликолем (ПЭГ) и ионообменной хроматографией. Функциональный вирусный титр определяли как по экспрессии репортерного белка mCherry в трансдуцированной линии HeLa, так и экспресс-тестами, основанными на иммунохроматографическом анализе (ИХА). Физический титр определяли методом ELISA. Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов здорового донора оценивали методом проточной цитометрии по интенсивности сигнала репортерного белка FusionRed. Функциональную активность полученных CAR T-клеток анти-CD19 оценивали с помощью микроскопии после совместного культивирования с клеточной линией CD19-HeLa+, а также последующего проведения теста на цитокины.

Результаты. Очистка и концентрирование лентивируса ультрафильтрацией позволили получить наивысшее число трансдуцированных клеток — 84,7 %. Методы ультрацентрифугирования, применения ПЭГ и ионообменной хроматографии продемонстрировали 56,08, 74,22 и 21,05 % трансдукции Т-клеток соответственно. Использование экспресс-тестов ИХА показало хорошую сопоставимость (r = 0,91) с данными, полученными титрованием на клеточной линии. Эффективность трансдукции Т-клеток в среднем составляла 59,55 ± 2,94 %, а максимальное значение достигало 76,26 %.

Заключение. В работе проведена оптимизация продукции CAR T-клеток на этапе получения лентивирусных векторов и их очистки. Метод ультрафильтрации был выбран как наиболее оптимальный способ концентрирования лентивирусного супернатанта, позволяющий осуществлять эффективную трансдукцию Т-лимфоцитов и генерировать функционально активную популяцию CAR T-клеток.

Ключевые слова: CAR T-лимфоциты, CD19, рекомбинантный лентивирус, концентрирование лентивирусного препарата.

Получено: 29 апреля 2020 г.

Принято в печать: 25 июня 2020 г.

Читать статью в PDF

ЛИТЕРАТУРА

  1. Blaese R, Culver K, Miller A, et al. T Lymphocyte-Directed Gene Therapy for ADA-SCID: Initial Trial Results After 4 Years. Science. 1995;270(5235):475–80. doi: 10.1126/science.270.5235.475.

  2. Kochenderfer J, Feldman S, Zhao Y, et al. Construction and Preclinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor. J Immunother. 2009;32(7):689–702. doi: 10.1097/cji.0b013e3181ac6138.

  3. Brentjens R, Latouche J, Santos E, et al. Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human T lymphocytes co-stimulated by CD80 and interleukin-15. Nat Med. 2003;9(3):279–86. doi: 10.1038/nm827.

  4. Pule M, Savoldo B, Myers G, et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 2008;14(11):1264–70. doi: 10.1038/nm.1882.

  5. Kochenderfer J, Dudley M, Feldman S, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor–transduced T cells. Blood. 2012;119(12):2709–20. doi: 10.1182/blood-2011-10-384388.

  6. Brentjens R, Davila M, Riviere I, et al. CD19-Targeted T Cells Rapidly Induce Molecular Remissions in Adults with Chemotherapy-Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia. Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930.

  7. Lewinski M, Bushman F. Retroviral DNA Integration—Mechanism and Consequences. Adv Genet. 2005;55:147–81. doi: 10.1016/s0065-2660(05)55005-3.

  8. Kochenderfer J, Dudley M, Carpenter R, et al. Donor-derived CD19-targeted T cells cause regression of malignancy persisting after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2013;122(25):4129–39. doi: 10.1182/blood-2013-08-519413.

  9. Cruz C, Micklethwaite K, Savoldo B, et al. Infusion of donor-derived CD19-redirected virus-specific T cells for B-cell malignancies relapsed after allogeneic stem cell transplant: a phase 1 study. Blood. 2013;122(17):2965–73. doi: 10.1182/blood-2013-06-506741.

  10. Grupp S, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia. N Engl J Med. 2013;368(16):1509–18. doi: 10.1056/nejmoa1215134.

  11. Kalos M, Levine B, Porter D, et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Sci Transl Med. 2011;3(95):95ra73. doi: 10.1126/scitranslmed.3002842.

  12. Qin D, Huang Y, Li D, et al. Paralleled comparison of vectors for the generation of CAR-T cells. Anticancer Drugs. 2016;27(8):711–22. doi: 10.1097/cad.0000000000000387.

  13. Gogol-Doring A, Ammar I, Gupta S, et al. Genome-wide Profiling Reveals Remarkable Parallels Between Insertion Site Selection Properties of the MLV Retrovirus and the piggyBac Transposon in Primary Human CD4+ T Cells. Mol Ther. 2016;24(3):592–606. doi: 10.1038/mt.2016.11.

  14. Izsvak Z, Hackett P, Cooper L, Ivics Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: Victories and challenges. BioEssays. 2011;33(6):478–9. doi: 10.1002/bies.201190025.

  15. Manuri P, Wilson M, Maiti S, et al. piggyBac Transposon/Transposase System to Generate CD19-Specific T Cells for the Treatment of B-Lineage Malignancies. Hum Gene Ther. 2010;21(4):427–37. doi: 10.1089/hum.2009.114.

  16. Nakazawa Y, Huye L, Salsman V, et al. PiggyBac-mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-specific Cytotoxic T-cells Expressing HER2-specific Chimeric Antigen Receptor. Mol Ther. 2011;19(12):2133–43. doi: 10.1038/mt.2011.131.

  17. Barrett D, Zhao Y, Liu X, et al. Treatment of Advanced Leukemia in Mice with mRNA Engineered T Cells. Hum Gene Ther. 2011;22(12):1575–86. doi: 10.1089/hum.2011.070.

  18. Dai X, Park J, Du Y, et al. One-step generation of modular CAR-T cells with AAV–Cpf1. Nat Meth. 2019;16(3):247–54. doi: 10.1038/s41592-019-0329-7.

  19. Mann R, Mulligan R, Baltimore D. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus. Cell. 1983;33(1):153–9. doi: 10.1016/0092-8674(83)90344-6.

  20. Le Doux J, Davis H, Morgan J, Yarmush M. Kinetics of retrovirus production and decay. Biotechnol Bioeng. 1999;63(6):654–62. doi: 10.1002/(sici)1097-0290(19990620)63:6<654::aid-bit3>3.0.co;2-1.

  21. Andreadis S, Brott D, Fuller A, Palsson B. Moloney murine leukemia virus-derived retroviral vectors decay intracellularly with a half-life in the range of 5.5 to 7.5 hours. J Virol. 1997;71(10):7541–8. doi: 10.1128/jvi.71.10.7541-7548.1997.

  22. Naldini L, Blomer U, Gallay P, et al. In Vivo Gene Delivery and Stable Transduction of Nondividing Cells by a Lentiviral Vector. Science. 1996;272(5259):263–7. doi: 10.1126/science.272.5259.263.

  23. Sakuma T, Barry M, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012;443(3):603–18. doi: 10.1042/bj20120146.

  24. Dull T, Zufferey R, Kelly M, et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J Virol. 1998;72(11):8463–71. doi: 10.1128/jvi.72.11.8463-8471.1998.

  25. Vannucci L, Lai M, Chiuppesi F, et al. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology. New Microbiol. 2013;36(1):1–22.

  26. Modlich U, Navarro S, Zychlinski D, et al. Insertional Transformation of Hematopoietic Cells by Self-inactivating Lentiviral and Gammaretroviral Vectors. Mol Ther. 2009;17(11):1919–28. doi: 10.1038/mt.2009.179.

  27. Sastry L, Xu Y, Duffy L, et al. Product-Enhanced Reverse Transcriptase Assay for Replication-Competent Retrovirus and Lentivirus Detection. Hum Gene Ther. 2005;16(10):1227–36. doi: 10.1089/hum.2005.16.1227.

  28. Cornetta K, Yao J, Jasti A, et al. Replication-competent Lentivirus Analysis of Clinical Grade Vector Products. Mol Ther. 2011;19(3):557–66. doi: 10.1038/mt.2010.278.

  29. Sena-Esteves M, Gao G. Titration of Lentivirus Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(4):pdb.prot095695. doi: 10.1101/pdb.prot095695.

  30. Kutner R, Zhang X, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495–505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.

  31. Merten O, Hebben M, Bovolenta C. Production of lentiviral vectors. Mol Ther Meth Clin Devel. 2016;3:16017. doi: 10.1038/mtm.2016.17.

  32. Sena-Esteves M, Tebbets J, Steffens S, et al. Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes. J Virol Meth. 2004;122(2):131–9. doi: 10.1016/j.jviromet.2004.08.017.

  33. Boudeffa D, Fenard D, Mormin M, et al. Development of Innovative Scalable Protocols for the Purification of Lentiviral Vectors Pseudotyped With GaLV-TR or Mutated Measles Virus Glycoproteins. Mol Ther. 2015;23:S214–S215. doi: 10.1016/s1525-0016(16)34143-0.

  34. Baekelandt V, Eggermont K, Michiels M, et al. Optimized lentiviral vector production and purification procedure prevents immune response after transduction of mouse brain. Gene Ther. 2003;10(23):1933–40. doi: 10.1038/sj.gt.3302094.

  35. Sanber K, Knight S, Stephen S, et al. Construction of stable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production. Sci Rep. 2015;5(1):9021. doi: 10.1038/srep09021.

  36. Зайцев Д.В., Зайкова Е.К., Головкин А.С. и др. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и технология CAR-T при солидных опухолях в эксперименте. Клиническая онкогематология. 2020;13(2):115–22. doi: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-115-122.[Zaytsev DV, Zaikova EK, Golovkin AS, et al. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and CAR-T Technology for Solid Tumors in Experiment. Clinical oncohematology. 2020;13(2):115–22. doi: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-115-122. (In Russ)]

  37. Петухов, А.В., Маркова, В.А., Моторин, Д.В. и др. Получение CAR T-лимфоцитов, специфичных к CD19, и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2018;11(1):1–9. doi: 10.21320/2500-2139-2018-11-1-1-9.[Petukhov AV, Markova VA, Motorin DV, et al. Manufacturing of CD19 Specific CAR T-Cells and Evaluation of their Functional Activity in Vitro. Clinical oncohematology. 2018;11(1):1–9. doi: 10.21320/2500-2139-2018-11-1-1-9. (In Russ)]