Молекулярная диагностика мутаций гена FLT3 у пациентов с острыми миелоидными лейкозами

Е.К. Зайкова1,2, Е.В. Белоцерковская1,2, Д.В. Зайцев1, А.В. Петухов1,2, О.А. Федорова2, Д.В. Моторин1, В.В. Иванов1, А.Ю. Зарицкий1, Л.Л. Гиршова1

1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

2 ФГБУН «Институт цитологии РАН», Тихорецкий пр-т, д. 4, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194064

Для переписки: Екатерина Васильевна Белоцерковская, канд. биол. наук, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; e-mail: belotserkovskaya.ev@gmail.com

Для цитирования: Зайкова Е.К., Белоцерковская Е.В., Зайцев Д.В. и др. Молекулярная диагностика мутаций гена FLT3 у пациентов с острыми миелоидными лейкозами. Клиническая онкогематология. 2020;13(2):150–60.

DOI: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-150-160


РЕФЕРАТ

Актуальность. Ген FLT3 является важным прогностическим молекулярным маркером при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ). Однако выявление мутаций FLT3 вызывает определенные трудности.

Цель. Сравнительный анализ методик, используемых для выявления мутации FLT3. Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей быстро и надежно определять мутационный статус FLT3.

Материалы и методы. В исследовании использовали образцы костного мозга, полученные от пациентов с ОМЛ. Для определения мутаций FLT3-ITD и FLT3-TKD выполняли ПЦР с последующей визуализацией с помощью электрофореза в агарозном геле. Результаты верифицировали методом секвенирования по Сэнгеру. Данные, полученные при использовании разработанной нами тест-системы, сравнивали с широко применяемым коммерческим набором FLT3 Mutation Assay for Gel Detection компании Invivoscribe.

Результаты. Разработан ПЦР-тест для определения мутационного статуса гена FLT3. Данный метод был апробирован на 22 образцах костного мозга от пациентов с ОМЛ. Мутация FLT3-ITD обнаружена у 4 пациентов, в то время как FLT3-TKD — у 3. У 1 больного одновременно присутствовали обе мутации. Результаты полностью согласовывались с данными молекулярно-генетического анализа гена FLT3, выполненного с помощью коммерческого набора FLT3 Mutation Assay for Gel Detection. Анализ данных, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, позволил валидировать выбранную методику.

Заключение. В статье приведен обзор всех существующих методик скрининга мутаций FLT3, а также описан опыт собственной разработки ПЦР-теста для выявления мутаций FLT3-ITD и FLT3-TKD. Выбранный метод представляется доступным по стоимости и более простым в исполнении по сравнению с другими. Настоящее исследование носит прикладной характер и может служить руководством как для врачей, так и научных сотрудников.

Ключевые слова: острые миелоидные лейкозы, мутации FLT3-ITD и FLT3-TKD.

Получено: 10 января 2020 г.

Принято в печать: 27 марта 2020 г.

Читать статью в PDF


ЛИТЕРАТУРА

  1. Kiyoi H, Naoe T, Yokota S, et al. Internal tandem duplication of FLT3 associated with leukocytosis in acute promyelocytic leukemia. 1997;11(9):1447–52. doi: 10.1038/sj.leu.2400756.

  2. Блау О.В. Мутации генов при острых миелоидных лейкозах. Клиническая онкогематология. 2016;9(3):245–56. doi: 10.21320/2500-2139-2016-9-3-245-256.

    [Blau OV. Genetic Mutations in Acute Myeloid Leukemia. Clinical oncohematology. 2016;9(3):245–56. doi: 10.21320/2500-2139-2016-9-3-245-256. (In Russ)]

  3. Gu T, Nardone J, Wang Y, et al. Survey of Activated FLT3 Signaling in Leukemia. PLoS ONE. 2011;6(4):e19169. doi: 10.1371/journal.pone.0019169.

  4. Deeb KK, Smonskey MT, Defedericis H-C, et al. Deletion and deletion/insertion mutations in the juxtamembrane domain of the FLT-3 gene in adult acute myeloid leukemia. Leuk Res Rep. 2014;3(2):86–9. doi: 10.1016/j.lrr.2013.09.003.

  5. Sandhofer N, Bauer J, Reiter K, et al. The new and recurrent FLT3 juxtamembrane deletion mutation shows a dominant negative effect on the wild-type FLT3 receptor. Sci Rep. 2016;6(1):28032. doi: 10.1038/srep28032.

  6. Thiede C, Steudel C, Mohr B, et al. Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis. Blood. 2002;99(12):4326–35. doi: 10.1182/blood.v99.12.4326.

  7. Metzeler K, Herold T, Rothenberg-Thurley M, et al. Spectrum and prognostic relevance of driver gene mutations in acute myeloid leukemia. Blood. 2016;128(5):686–98. doi: 10.1182/blood-2016-01-693879.

  8. Schnittger S, Bacher U, Haferlach C, et al. Diversity of the juxtamembrane and TKD1 mutations (Exons 13–15) in the FLT3 gene with regards to mutant load, sequence, length, localization, and correlation with biological data. Genes Chromos Cancer. 2012;51(10):910–24. doi: 10.1002/gcc.21975.

  9. Kottaridis P, Gale R, Frew M, et al. The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials. Blood. 2001;98(6):1752–9. doi: 10.1182/blood.v98.6.1752.

  10. Moreno I, Martin G, Bolufer P, et al. Incidence and prognostic value of FLT3 internal tandem duplication and D835 mutations in acute myeloid leukemia. Haematologica. 2003;88(1):19–24.

  11. Bacher U, Haferlach C, Kern W, et al. Prognostic relevance of FLT3-TKD mutations in AML: the combination matters—an analysis of 3082 patients. Blood. 2008;111(5):2527–37. doi: 10.1182/blood-2007-05-091215.

  12. Moore AS, Faisal A, Gonzalez de Castro D, et al. Selective FLT3 inhibition of FLT3-ITD+ acute myeloid leukaemia resulting in secondary D835Y mutation: a model for emerging clinical resistance patterns. Leukemia. 2012;26(7):1462–70. doi: 10.1038/leu.2012.52.

  13. Bagrintseva K, Geisenhof S, Kern R, et al. FLT3-ITD-TKD dual mutants associated with AML confer resistance to FLT3 PTK inhibitors and cytotoxic agents by overexpression of Bcl-x(L). Blood. 2005;105(9):3679–85. doi: 10.1182/blood-2004-06-2459.

  14. Dohner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 2017;129(4):424–47. doi: 10.1182/blood-2016-08-733196.

  15. O’Donnell MR, Tallman MS, Abboud CN, et al. Acute myeloid leukemia, version 3.2017, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. J Natl Compr Canc Netw. 2017;15(7):926–57. doi: 10.6004/jnccn.2017.0116.

  16. Nakao M, Yokota S, Iwai T, et al. Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia. 1996;10(12):1911–8.

  17. Kim Y, Lee GD, Park J, et al. Quantitative fragment analysis of FLT3-ITD efficiently identifying poor prognostic group with high mutant allele burden or long ITD length. Blood Cancer J. 2015;5(8):e336. doi: 10.1038/bcj.2015.61.

  18. Lin PH, Lin CC, Yang HI, et al. Prognostic impact of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia patients with internal tandem duplication of FLT3. Leuk Res. 2013;37(3):287–92. doi: 10.1016/j.leukres.2012.10.005.

  19. Grunwald MR, Tseng LH, Lin MT, et al. Improved FLT3 internal tandem duplication PCR assay predicts outcome after allogeneic transplant for acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 2014;20(12):1989–95. doi: 10.1016/j.bbmt.2014.08.015.

  20. Murphy KM, Levis M, Hafez MJ, et al. Detection of FLT3 internal tandem duplication and D835 mutations by a multiplex polymerase chain reaction and capillary electrophoresis assay. J Mol Diagn. 2003;5(2):96–102. doi: 10.1016/s1525-1578(10)60458-8.

  21. Stirewalt DL, Willman CL, Radich JP. Quantitative, real-time polymerase chain reactions for FLT3 internal tandem duplications are highly sensitive and specific. Leuk Res. 2001;25(12):1085–8. doi: 10.1016/s0145-2126(01)00087-x.

  22. Beretta C, Gaipa G, Rossi V, et al. Development of a quantitative-PCR method for specific FLT3/ITD monitoring in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2004;18(8):1441–4. doi: 10.1038/sj.leu.2403409.

  23. Daver N, Schlenk RF, Russell NH, et al. Targeting FLT3 mutations in AML: review of current knowledge and evidence. Leukemia. 2019;33(2):299–312. doi: 10.1038/s41375-018-0357-9.

  24. Patnaik MM. The importance of FLT3 mutational analysis in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2018;59(10):2273–86. doi: 10.1080/10428194.2017.1399312.

  25. Kamps R, Brandao RD, Bosch BJ, et al. Next-generation sequencing in oncology: genetic diagnosis, risk prediction and cancer classification. Int J Mol Sci. 2017;18(2):308. doi: 10.3390/ijms18020308.

  26. Chin EL, da Silva C, Hegde M. Assessment of clinical analytical sensitivity and specificity of next-generation sequencing for detection of simple and complex mutations. BMC Genet. 2013;14(1):6. doi: 10.1186/1471-2156-14-6.

  27. Bibault JE, Figeac M, Helevaut N, et al. Next-generation sequencing of FLT3 internal tandem duplications for minimal residual disease monitoring in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 2015;6(26):22812–21. doi: 10.18632/oncotarget.4333.

  28. Spencer DH, Abel HJ, Lockwood CM, et al. Detection of FLT3 Internal Tandem Duplication in Targeted, Short-Read-Length, Next-Generation Sequencing Data. J Mol Diagn. 2013;15(1):81–93. doi: 10.1016/j.jmoldx.2012.08.001.

  29. Au CH, Wa A, Ho DN, et al. Clinical evaluation of panel testing by next-generation sequencing (NGS) for gene mutations in myeloid neoplasms. Diagn Pathol. 2016;11(1):11. doi: 10.1186/s13000-016-0456-8.

  30. Abdelhamid E, Preudhomme C, Helevaut N, et al. Minimal residual disease monitoring based on FLT3 internal tandem duplication in adult acute myeloid leukemia. Leuk Res. 2012;36(3):316–23. doi: 10.1016/j.leukres.2011.11.002.

  31. Schranz K, Hubmann M, Harin E, et al. Clonal heterogeneity of FLT3-ITD detected by high-throughput amplicon sequencing correlates with adverse prognosis in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 2018;9(53):30128–45. doi: 10.18632/oncotarget.25729.

  32. Thiede C, Prior T, Lavorgna S, et al. FLT3 mutation Assay Laboratory Cross Validation: Results from the CALGB 10603/Ratify Trial in Patients with Newly Diagnosed FLT3-Mutated Acute Myeloid Leukemia (AML). Blood. 2018;132(Suppl_1):2800. doi: 10.1182/blood-2018-99-112127.

  33. Сабурова И.Ю., Горбунова А.В., Слободнюк К.Ю. и др. Выявление внутренних тандемных дупликаций и мутации D835Y в гене FLT3 у пациентов с острым миелобластным лейкозом. Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова. 2010;XVII(3):48–51.

    [Saburova IYu, Gorbunova AV, Slobodnyuk KYu, et al. Detection of FLT3 internal tandem duplications and D835Y mutation in patients with acute myeloid leukemia. Uchenye zapiski Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta imeni akademika I.P. Pavlova. 2010;XVII(3):48–51. (In Russ)]

  34. Петрова Е.В., Мартынкевич И.С., Полушкина Л.Б. и др. Клинические, гематологические и молекулярно-генетические особенности острых миелобластных лейкозов с мутациями в генах FLT3, CKIT, NRAS и NPM1. Гематология и трансфузиология. 2016;61(2):72–80. doi: 10.18821/0234-5730-2016-61-2-72-80.

    [Petrova EV, Martynkevich IS, Polushkina LB, et al. Clinical, hematological and molecular-genetic features of acute myeloid leukemia with mutations in FLT3, CKIT, NRAS and NPM1. Russian journal of hematology and transfusiology. 2016;61(2):72–80. doi: 10.18821/0234-5730-2016-61-2-72-80. (In Russ)]

  35. Гук Л.В., Савицкая Т.В., Домнинский Д.А. и др. Анализ частоты и прогностического значения мутаций генов FLT3, c-KIT и NPM1 у детей с острым миелобластным лейкозом. Онкогематология. 2009;4(4):27–32.

    [Guk LV, Savitskaya TV, Domninskii DA, et al. Analysis of incidence and prognostic value of FLT3, c-KIT and NPM1 genes mutations in children with acute myeloid leukemia. Onkogematologiya. 2009;4(4):27–32. (In Russ)]

  36. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах. Российский онкологический журнал. 2013;4:34–5.

    [Vinogradov AV. Development of the technique for CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 genes mutation detection in acute myeloid leukemia. Rossiiskii onkologicheskii zhurnal. 2013;4:34–5. (In Russ)]

  37. Kiyoi H, Naoe T, Nakano Y, et al. Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia. Blood. 1999;93(9):3074–80.

  38. Gari M, Abuzenadah A, Chaudhary A, et al. Detection of FLT3 oncogene mutations in acute myeloid leukemia using conformation sensitive gel electrophoresis. Int J Mol Sci. 2008;9(11):2194–204. doi: 10.3390/ijms9112194.

  39. Sly N, Gaspar K. Midostaurin for the management of FLT3-mutated acute myeloid leukemia and advanced systemic mastocytosis. Am J Health-Syst Pharm. 2019;76(5):268–74. doi: 10.1093/ajhp/zxy050.

  40. Bazarbachi AH, Hamed RA, Malard F, et al. Allogeneic transplant for FLT3-ITD mutated AML: a focus on FLT3 inhibitors before, during, and after transplant. Ther Adv Hematol. 2019;10:1–14. doi: 10.1177/2040620719882666.

  41. Levis M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013? Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013;2013:220–6. doi: 10.1182/asheducation-2013.1.220.